09.08.2021

Вирусо-векторная медицина или как в. Коксаки борется с ишемией, в. герпеса - с детскими опухолями, в. осповакцины занимается доставкой и т.д.

Колесниченко Ю.Ю., врач УЗД, www.uzgraph.ru

Метки: Последние публикации, вакцинология, дайджест, инфектология, новости

Содержание:

По данным публикации в журнале Болезни (Diseases) за май 2018г.: Viral Vectors in Gene Therapy / Вирусные векторы в генной терапии - внешняя ссылка

После подлинного ажиотажа в 1990-х годах по поводу потенциала генной терапии, обеспечивающего более или менее неограниченные возможности для лечения большинства заболеваний человека, произошла серьезная неудача, когда аденовирусные векторы были использованы для лечения не опасного для жизни заболевания орнитин-транскарбомилазы, что привело к смерти молодого пациента. Более того, хотя был достигнут успех в лечении детей с тяжелым комбинированным иммунодефицитом (SCID), интеграция терапевтического гена, доставляемого ретровирусом, в область протоонкогена LMO2 вызвала развитие лейкемии у некоторых людей. Эти две неудачи были явно связаны с неопытностью в дизайне клинических испытаний и, возможно, излишне оптимистичным отношением к вопросам безопасности, связанным с доставкой вирусных векторов для применения в генной терапии. Однако результатом был серьезный скептицизм по отношению к генной терапии в целом, что привело к сокращению финансирования, инициированию клинических испытаний и поддержке со стороны фармацевтической и биотехнологической промышленности. К счастью, опытные генные терапевты продемонстрировали твердую приверженность векторной инженерии для решения проблем доставки и безопасности, что способствовало второму пришествию генной терапии.

Сегодня как вирусные, так и невирусные векторы переживают возрождение инновационных модификаций и применений как в доклинических, так и в клинических условиях. Поскольку этот обзор посвящен вирусным векторам, подходы к невирусной генной терапии не будут обсуждаться далее. Вместо этого представлен обзор различных вирусных векторов на основе аденовирусов, аденоассоциированных вирусов (ААВ), альфавирусов, флавивирусов, вирусов простого герпеса (ВПГ), вирусов кори, рабдовирусов, ретровирусов, лентивирусов, вируса болезни Ньюкасла (NDV), вирусов оспы и пикорнавирусы будут обсуждаться. Однако большое количество вирусных векторов, оцененных по ряду показаний к заболеванию, позволяет представить применения генной терапии только на выбранных примерах.

Вирусные векторы

Спектр вирусных векторов очень широк, включая как средства доставки, разработанные для временной краткосрочной, так и постоянной долгосрочной экспрессии. Более того, типы векторов представлены как РНК, так и ДНК-вирусами с одноцепочечным (оц) или двухцепочечным (дц) геномом.

Типы векторов

Наиболее часто применяемые вирусные векторы, безусловно, основаны на аденовирусах. Аденовирусы «голой» дцДНК обладают способностью упаковки чужеродной ДНК в 7,5 т.п.н.(*тысяча пар нуклеотидов), обеспечивая кратковременную эписомальную экспрессию интересующего гена в относительно широком диапазоне клеток-хозяев. Исходные аденовирусные векторы вызывали сильные иммунные ответы, в то время как так называемые выпотрошенные векторы второго и третьего поколения, содержащие делеции, вызывают значительно сниженную иммуногенность. Большое внимание было уделено разработке упаковывающих клеточных линий для крупномасштабного производства рекомбинантных частиц качества надлежащей производственной практики (GMP) для поддержки клинических испытаний. Векторы ААВ несут небольшой геном оцРНК, который позволяет упаковывать только вставки размером 4 т.п.н. Обычно считается, что ААВ вызывает низкую патогенность и токсичность и обеспечивает долгосрочную экспрессию трансгена за счет хромосомной интеграции. Одно ограничение использования ААВ связано с иммунным ответом, вызванным повторным введением. Эта проблема была решена путем применения разных серотипов ААВ для каждого повторного введения. Другая проблема связана с ограниченной способностью упаковывать чужеродную ДНК в рекомбинантные частицы ААВ. Этот недостаток был устранен путем разработки двойных векторов ААВ.

Вирусы простого герпеса (ВПГ) представляют собой вирусы дцДНК с крупной оболочкой, характеризующиеся их литической и латентной природой инфекции, что приводит к латентной инфекции нейронов на протяжении всей жизни и обеспечивает долгосрочную экспрессию трансгена. Делеция генов ВПГ привела к созданию векторов экспрессии с низкой токсичностью и отличной упаковочной способностью для чужеродной ДНК размером > 30 т.п.н. В отличие от ВПГ, ретровирусы обладают геномом оцРНК со структурой оболочки. Обычно ретровирусы случайным образом интегрируются в геном хозяина, что, как описано ранее, является проблематичным при терапии пациентов с SCID. Однако этот недостаток привел к разработке более безопасных векторов, демонстрирующих целевую интеграцию, а также улучшенных линий вспомогательных клеток. Ретровирусы могут содержать до 8 т.п.н. чужеродных вставок и представляют собой векторы золотого стандарта для долгосрочных применений генной терапии. Одним из недостатков ретровирусов является их неспособность инфицировать неделящиеся клетки, что повысило интерес к применению лентивирусных векторов для генной терапии. Хотя лентивирусы принадлежат к семейству ретровирусов, они обладают способностью инфицировать как делящиеся, так и неделящиеся клетки, обеспечивая низкую цитотоксичность. Обладая такой же упаковочной способностью и хромосомной интеграцией, что и обычные ретровирусы, лентивирусы стали привлекательными для терапевтических применений, требующих длительной экспрессии.

Самоусиливающиеся оцРНК-вирусы состоят из альфавирусов (вирус леса Семлики, вирус Синдбис, вирус венесуэльского конского энцефалита и M1) и флавивирусов (вирус Кунджин, вирус Западного Нила и вирус Денге), обладающих геномом положительной полярности. Напротив, рабдовирусы (вирус бешенства и везикулярного стоматита) и вирусы кори несут геномы с отрицательной цепью. Большинство самоамплифицирующихся РНК-вирусов обладают упаковочной способностью 6-8 т.п.н. и генерируют высокие уровни кратковременной временной экспрессии генов. Кроме того, оцРНК парамиксовирус вируса болезни Ньюкасла (NDV) реплицируется специфически в опухолевых клетках и поэтому часто применяется для генной терапии рака. Более того, векторы, нацеленные на онколитические раковые клетки, были сконструированы для многих из перечисленных выше оцРНК вирусов. Другое семейство вирусов оцРНК без оболочки, а именно вирусы Коксаки, принадлежащие к Picornaviridae, применялись в качестве онколитических векторов.

Кроме того, в качестве векторов доставки применялись вирусы оспы и особенно вирусы осповакцины. Характерной особенностью поксвирусов является их геном дцДНК, который может вместить более 30 т.п.н. чужеродной ДНК. Созданы векторы поксвируса, способные к селективной репликации опухолей, вызывающие некроз у нечеловеческих приматов. Кроме того, векторы осповакцины, которые реплицируются в опухолевых клетках без повреждения нормальных клеток, были сконструированы путем делеций в генах тимидинкиназы (TK) и фактора роста осповакцины (VGF).

Доклинические испытания

Аденовирусы

В связи с многочисленными применениями в генной терапии ряда вирусных векторов, оцениваемых на доклинических моделях животных, здесь могут быть представлены только некоторые примеры. В этом контексте онколитические аденовирусы показали большие перспективы в терапии рака. Например, онколитический аденовирус, созданный с помощью лиганда, нацеленного на рак поджелудочной железы SYENFSA (SYE), специфически инфицированного и реплицируемого в раковых клетках, но не в нормальных клетках, обеспечил эффективный онколиз протоковой аденокарциномы поджелудочной железы (PDAC). Вектор AdSur-SYE, регулируемый промотором сурвивина, также показал высокую эффективность трансдукции в нейроэндокринных опухолях поджелудочной железы (PNET). Внутриопухолевое введение AdSur-SYE привело к полной регрессии подкожных опухолей на мышиной модели. В другом подходе были сконструированы химерные векторы аденовирусов типа 5 и 3, которые могут избирательно реплицироваться в раковых клетках. Обеспечение одновременной экспрессии секретируемого гена-7, связанного с дифференцировкой меланомы (MDA-7) и интерлейкина-12 (L-24) из химерного вектора Ad5 / 3, приводило к селективной гибели опухолевых клеток после внутриопухолевой инъекции на животных моделях. Более того, терапевтическая активность также была ограничена незараженными отдаленными опухолями из-за так называемой «противоопухолевой активности стороннего наблюдателя». Для дальнейшего повышения терапевтической эффективности химерный вектор Ad5 / 3 инкапсулировали в микропузырьки для «скрытой доставки». Обработка ультразвуком высвобождала и тем самым запускала репликацию вектора, который вместе с секрецией MDA-7 / IL-24 увеличивал терапевтическую активность, включая стимулирование апоптоза и ингибирование ангиогенеза опухоли. Из-за обычно ограниченной продолжительности терапевтической активности аденовирусной генной терапии, гибридные аденовирусные векторы, использующие систему транспозаз «Спящая красавица», или сгруппированные с регулярными интервалами короткие палиндромные повторы (CRISPR), связанные с нуклеазой протеина-9, были использованы для хромосомной интеграции и постоянного редактирования генов. соответственно. Онколитические аденовирусные векторы также использовались в сочетании с экспрессией иммуномодулирующих белков. Этот подход может изменить микроокружение опухоли с иммуносупрессивного на иммунно-уязвимое из-за активации цитотоксических Т-клеток. В другом подходе онколитический аденовирус Enadenotucirev, химерный вектор Ad11p и Ad3, продемонстрировал избирательное размножение и уничтожение опухолевых клеток. Из-за невозможности репликации в клетках животных, Enadenotucirev оценивали на панели первичных клеток человека, которая продемонстрировала > 100-кратный более высокий уровень вирусного генома в опухолевых клетках, чем в нормальных клетках. Кроме того, у мышей оценивали переносимость внутривенного введения. Устойчивость к инактивации компонентами крови человека потенциально делает возможным внутривенное введение вектора.

Аденоассоциированные вирусы

Связанное с Х-хромосомой расстройство нервного развития, названное синдромом Ретта (RTT), стало мишенью для векторов ААВ в мышиной модели RTT. Векторы ААВ, экспрессирующие регулятор транскрипции метил-CpG-связывающий белок 2 (MeCP2), доставляемый непосредственно в спинномозговую жидкость (CSF), проявляли дозозависимые побочные эффекты, но также увеличивали выживаемость мышей RTT. Более того, смертельная нейродегенеративная болезнь Хантингтона (HD) была оценена для терапии на основе ААВ на модели мышей HD. Трансгенным HD-овцам, экспрессирующим полноразмерный ген хантингтина человека (HTT), инъецировали миРНК ААВ9, нацеленную на экзон 48 мРНК HTT человека. Результатом было снижение уровня мРНК HTT человека и 50–80% белка HTT в полосатом теле, что указывает на безопасное и эффективное подавление гена. На муковисцидоз нацелена экспрессия на основе ААВ регулятора трансмембранной проводимости муковисцидоза (CFTR) в ряде моделей на животных, показывающих хороший профиль безопасности, хотя и без явных клинических преимуществ. Недавно серотипы ААВ1 и ААВ5 были протестированы с использованием двойной люциферазной репортерной системы на основе люцифераз светлячка и Renilla соответственно. И ААВ1, и ААВ5 были доставлены в легкие макак-резусов с помощью микроспрыскивания, что привело к увеличению числа векторных геномов ААВ1 в 10 раз по сравнению с ААВ5. Однако активность люциферазы на основе ААВ1 не была статистически выше по сравнению с ААВ5. Более того, сывороточные нейтрализующие антитела показали резкое увеличение для обоих серотипов ААВ. Не было никаких побочных эффектов, указывающих на безопасное введение ААВ, что поддерживает дополнительные клинические испытания, особенно с более легочно-тропным серотипом ААВ1. В другом подходе векторы ААВ были применены для лечения мышечных дистрофий Дюшенна и пояса конечностей. Кроме того, технология двойного ААВ позволила экспрессировать собачий мини-дистрофин ΔH2-R15 размером 7 т.п.н. с использованием пары двойных векторов ААВ. ААВ9 вводили в локтевой разгибатель запястья на собачьей модели мышечной дистрофии Дюшенна. Результатом была широко распространенная экспрессия мини-дистрофина, восстановление гликопротеинового комплекса, связанного с дистрофином, уменьшение мышечной дегенерации и улучшение распределения миофибрилл по размерам. В контексте гемофилии А были сконструированы печеночно-специфические промоторные и энхансерные элементы с кодон-оптимизированным геном фактора свертывания крови VIII (hFVIII) человека. Одну конструкцию промотор-энхансер с высокой иммуногенностью к hFVIII оценивали на модели мыши с нокаутом FVIII с применением векторов ААВ8, ААВ9, ААВhu37 и ААВrh64R1. На основе образования антител против hFVIII векторы были разделены на одну группу, в которой менее 20% мышей (ААВ8 и ААВ9), а в другой - более 20% мышей (ААВrh10, ААВhu37 и ААВrh64R1) генерировали анти- антитела к hFVIII.

Вирусы простого герпеса

Благодаря долгосрочному эффекту векторы ВПГ нашли множество применений при различных заболеваниях. Например, экспрессия провоспалительных цитокинов на основе ВПГ оказалась полезной при лечении болезненной диабетической невропатии. В этом контексте непрерывная доставка ВПГ-IL-10 в нервные волокна мышей с диабетом I типа блокирует ноцицептивные и стрессовые реакции при трансдукции ганглия задних корешков (DRG). Было высказано предположение, что активация макрофагов в периферической нервной системе участвует в патогенезе боли и что экспрессия цитокинов на основе ВПГ ингибирует развитие болезненной невропатии. В другом подходе введение нереплицирующихся векторов ВПГ, экспрессирующих факторы роста, в кожу мышей приводило к трансдукции DRG и предотвращало прогрессирование сенсорной нейропатии, не вызывая каких-либо побочных эффектов. Связанные с раком, онколитические векторы ВПГ применялись в нескольких доклинических исследованиях. Геном вектора ВПГ-1 HF10 включает неинженерные делеции, мутации и мутации со сдвигом рамки считывания, в которых отсутствует экспрессия UL43, UL48.5, UL55, UL56 и транскриптов, связанных с латентностью, при этом демонстрируется сверхэкспрессия UL53 и UL54. ВПГ-1 HF10 эффективно реплицируется в опухолевых клетках, вызывая обширное цитотоксическое повреждение. Более того, в опухолях индуцировались активированные CD4+ и CD8+ Т-клетки и естественные клетки-киллеры опухолей, что приводило к значительному снижению роста опухоли и увеличению выживаемости. Онколитические векторы ВПГ-2 также были оценены в исследованиях на животных раковых клеток толстой кишки и раковых стволовых клеток (CSLC) и, как известно, являются онкогенными и ответственными за рецидивы и метастазирование рака. Значительное ингибирование роста опухоли наблюдалось после введения онколитических векторов ВПГ-2.

Ретровирусы

Ретровирусы представляют собой классический подход к долгосрочным применениям генной терапии, и первое испытание генной терапии на людях включало имплантацию аутологичных клеток костного мозга, трансдуцированных ex vivo с помощью векторов гамма-ретровируса. Совсем недавно внимание было уделено дендритным клеткам-мишеням (ДК) путем конструирования векторов со специфическими для ДК промоторами или путем переназначения тропизма вектора. Кроме того, трансдукция гемопоэтических стволовых клеток поддерживает антиген-специфическую иммунную толерантность. В другом подходе иммунотерапии низкая эффективность трансдукции гена у 50% Т (CAR-T) -клеток, экспрессирующих химерный антигенный рецептор, была улучшена до более чем 90% за счет оптимизации условий предварительного культивирования и стимуляции антителами. Трансдуцированные клетки CAR-T проявляли антиген-специфическую цитотоксическую активность и секретировали цитокины при стимуляции антигеном. Связанный с терапией рака, нелитический ретровирусный реплицирующий вектор (RRV) Toca 511, кодирующий дрожжевую цитозиндезаминазу (CD), был доставлен в опухоли на моделях ортотопической глиомы. В сочетании с 5-фторцитозином (5-FC) CD в инфицированных опухолевых клетках превращает 5-FC в 5-фторурацил (5-FU), что приводит к гибели клеток. Внутривенное или внутричерепное введение Toca 511 обеспечивало долгосрочное выживание иммунокомпетентных мышей после комбинированного лечения 5-FC. Продолжительное выживание наблюдали также у животных с ранее существовавшим иммунным ответом на вектор, который поддерживает возможность повторного введения. Было продемонстрировано, что самоинактивирующийся гаммаретровирусный вектор (SINfes.gp91s), содержащий трансген с оптимизированными кодонами (gp91 (phax)) и промотор для X-связанной формы иммунодефицита, называемого хронической гранулематозной болезнью (CGD), защищает X- Мыши CGD после заражения Aspergillus fumigatus.

Лентивирусы

В случае генной терапии на основе лентивирусов, лентивирусный вектор, несущий промотор дефицита пируваткиназы человека (hPKD) и ген PKLR, был использован для борьбы с PKD моногенного метаболического заболевания, вызванного мутациями в гене изоферментов пируваткиназы L / R (PKLR). Когда мышиные гемопоэтические стволовые клетки (HSC), трансдуцированные лентивирусом, трансплантировали мышам с миеоблированной PKD, эритроидный компартмент нормализовался, обеспечивая скорректированный гематологический фенотип и реверсию патологии органа. Кроме того, анализ участков геномной вставки лентивирусного вектора в трансплантированные гематопоэтические клетки показал отсутствие генотоксичности. Лентивирусные векторы также были подвергнуты генной терапии для подавления РНК в ЦНС. Связанная с болезнью Паркинсона (БП) неправильная регуляция и сверхэкспрессия α-синуклеина, ведущая к его накоплению в нейронах, нейтрализовалась РНК-интерференцией на основе лентивируса (РНКи) в линии дофаминергических клеток человека SH-SY5Y и в нейронах полосатого тела крысы [51 ]. Более того, в другом подходе связанная с PD повышающая регуляция транскрипции GABA-продуцирующего фермента глутаматдекаорбоксилазы 1 (GAD1) или GAD67 была успешно подавлена лентивирусной экспрессией shРНК-miR в модели БП на крысах, демонстрируя нормализованную нейрональную активность. В контексте болезни Альцгеймера лентивирусные векторы применялись для подавления РНК, чтобы подавить расщепление BACE1 аттенуированного белка-предшественника амилоида (АРР) и продукцию β-амилоида, что привело к снижению нейродегенерации и поведенческих дефицитов на мышиной модели болезни Альцгеймера. В другом подходе экспрессия siРНК на основе лентивируса показала снижение фосфорилирования тау и количества нейрофибриллярных клубков на мышиной модели болезни Альцгеймера. Кроме того, доставка shРНК на основе лентивирусного вектора, нацеленная на корецептор ВИЧ-1 CCR5 и R-область длинного концевого повтора ВИЧ-1 (LTR), была оценена на гуманизированных мышах костного мозга / тимуса (hu-BLT). Результатом было эффективное подавление ВИЧ-инфекции и, возможно, потенциальная терапия против ВИЧ. В другом подходе лентивирусный вектор Cal-1 против ВИЧ был оценен на свинохвостых макаках. Лентивирус Cal-1 продемонстрировал безопасную интеграцию и доклиническую безопасность.

Альфавирусы

Альфавирусы в основном применялись в доклинических исследованиях генной терапии для лечения рака. Особенностью является то, что альфавирусные векторы могут быть доставлены в форме «голой» РНК, слоистых векторов плазмидной ДНК и рекомбинантных частиц с дефицитом или репликацией. В этом контексте местное введение репликационного вектора вируса леса Семлики (SFV), экспрессирующего EGFP, увеличивало выживаемость мышей с имплантированными ксенотрансплантатами карциномы легких A549. В другом исследовании терапия на основе SFV-IL-12 оценивалась на сингенной модели глиомы крысы RG2, что привело к уменьшению объема опухоли на 87% и значительному увеличению выживаемости. В попытках нацелить репликацию опухолевых клеток в геном SFV были введены шесть микро-РНК (миРНК). Внутрибрюшинное введение сконструированных частиц SFV4-miRT124 мышам BALB/c привело к нацеливанию на глиому, ограниченному распространению в ЦНС и значительному увеличению выживаемости. Более того, было продемонстрировано, что встречающийся в природе онколитический альфавирус M1 избирательно убивает раковые клетки, дефицитные по противовирусному белку цинкового пальца (ZAP), а также продемонстрировал высокий опухолевый тропизм и сильную онколитическую активность на модели опухоли печени.

Флавивирусы

Что касается флавивирусов, гранулоцитарный макрофагальный колониестимулирующий фактор (GM-CSF), экспрессируемый из вектора вируса Кунджин, подвергали внутриопухолевому введению мышам с подкожной карциномой толстой кишки CT26. Лечение привело к излечению более 50% мышей, которым вводили инъекцию; опухоли не определялись через 18 дней после введения Kunjin-GM-CSF. Аналогичным образом, лечение опухолей меланомы B16-OVA привело к значительной регрессии опухоли через 5 дней, а показатель излечения у мышей достиг 67%. Более того, подкожная инъекция Kunjin-GM-CSF приводила к регрессии метастазов в легкие CT26 у мышей BALB/c.

Рабдовирусы

Среди рабдовирусов рекомбинантный вирус везикулярного стоматита (VSV) применялся для доклинических испытаний генной терапии. Низкая распространенность серотипов у людей и устойчивый профиль гетерологичной экспрессии поддержали ряд подходов к вакцинам против патогенов человека. Например, векторы VSV, экспрессирующие Gag и Env ВИЧ-1, вызвали устойчивые ВИЧ-1-специфические клеточные и гуморальные иммунные ответы у нечеловеческих приматов. Кроме того, вакцинированные животные были защищены от заражения патогенным рекомбинантным вирусом SIV / ВИЧ. Однако нейровирулентность векторов VSV остается проблемой, ведущей к стратегиям разработки ослабленных векторов. В другом подходе, химерный вектор VSV, где G-оболочка VSV была заменена гликопротеином вируса лимфоцитарного хориоменингита (LCMV-GP), химерный вектор не наносил вреда нормальным клеткам мозга, но эффективно элиминировал опухолевые клетки мозга в нескольких моделях опухолей в vivo. Более того, было подтверждено безопасное системное введение у мышей и не было обнаружено гуморальной активности против VSV, что послужило основанием для повторных системных инъекций. В рамках подготовки к будущим клиническим испытаниям онколитический вектор VSV-IFNβ-NIS, экспрессирующий интерферон-β (IFNβ) и переносчик йодида натрия (NIS), оценивался на доклинических моделях на грызунах. Например, дозозависимая регрессия опухоли была продемонстрирована у мышей C57BL1 / KaLwRij, которым имплантировали сингенные опухоли плазмоцитомы 5TGM1. Однако ксенотрансплантаты KAS6/1 регрессировали при всех дозах VSV, испытанных на мышах SCID. Более того, специально выведенных собак с опухолями естественного происхождения подвергали исследованию с увеличением дозы VSV-IFNβ-NIS. Максимальная переносимая доза (МПД) для внутривенного введения была определена как 1010 TCID50 с легкими и умеренными побочными эффектами. Геном VSV быстро исчез, и антитела против VSV были обнаружены через 5 дней после введения в крови. Однако инфекционный вирус не был обнаружен в плазме, моче или буккальных мазках(*мазок со слизистой оболочки щеки). В другом исследовании экспрессия муцина 1 человека (MUC1) на основе VSV обеспечивала значительное снижение роста опухоли у мышей с установленными ксенотрансплантатами аденокарциномы протока поджелудочной железы. Кроме того, комбинация VSV-MUC1 и гемцитабина приводила к превосходной терапевтической эффективности.

Вирусы кори

Вирусы кори нашли ряд применений в генной терапии, которые оценивались на доклинических моделях на животных. В этом контексте онколитический MV-Edm был разработан для экспрессии NIS, который деплецировался при агрессивном и устойчивом к радиоактивному йоду анапластическом раке щитовидной железы (ATC). Обработка MV-NIS подтвердила экспрессию NIS и усиление уничтожения опухолей. В другом подходе был разработан вирус кори для экспрессии дрожжевого бифункционального суицидного гена, кодирующего цитозиндезаминазу и урацилфосфорибозилтрансфреразу, названную суперцитозиндезаминазой (SCD). Химерный белок способен превращать нетоксичное пролекарство 5-фторцитозин (5-FC) в высоко цитотоксический 5-фторурацил (5-FU). Кроме того, 5-FU напрямую превращается в 5-фторуридинмонофосфат (5-FUMP), что решает проблему химической устойчивости к 5-FU при лечении рака. Трансдукция с помощью MV-SCD показала репликацию и эффективный лизис линий клеток рака яичников человека и первичных опухолевых клеток. Более того, прецизионные срезы опухолей пациентов с раком яичников человека продемонстрировали эффективное инфицирование MV-SCD. MV-SCD также продемонстрировал сильную онколитическую активность на мышиной модели ксенотрансплантата гепатоцеллюлярной карциномы (ГЦК) человека. Кроме того, MV-SCD вызывал долгосрочную репликацию вируса в опухолевой ткани и индуцировал апоптозоподобную гибель клеток независимо от интактных путей апоптоза. В другом исследовании MV-SCD вводили внутриопухолево в сочетании с системным 5-FU на модели ксенотрансплантата TFK-1 на мышах, что привело к значительному уменьшению опухоли. Более того, уменьшение опухоли и значительное улучшение выживаемости наблюдались в модели ксенотрансплантата HuCCT1.

Вирусы болезни Ньюкасла

Переносчики вируса болезни Ньюкасла (NDV) часто использовались в доклинических исследованиях терапии рака из-за их онколитической активности. Хотя векторы NDV, экспрессирующие IL-2, были многообещающими, были проведены сравнительные исследования с менее токсичным IL-15. Внутриопухолевое введение NDV-IL15 и NDV-IL2 мышам с меланомой показало эффективное подавление роста опухоли. Однако 120-дневная выживаемость после лечения NDV-IL15 была на 12,5% выше, чем у NDV-IL2. Аналогичным образом, выживаемость была на 26,6% выше для лечения NDV-IL15 в эксперименте по повторному лечению опухоли. В другом исследовании обратная генетика была использована на онколитическом штамме NDV D90 для создания рекомбинантных NDV, несущих ген GFP. Спасенный вирус продемонстрировал избирательную репликацию опухоли и индуцировал апоптоз в опухолевых клетках у бестимусных мышей с имплантированными опухолями легких. Также было продемонстрировано, что экспрессия IL-2 и связанного с фактором некроза опухоли лиганда, индуцирующего апоптоз (TRAIL), увеличивает присущую ему антинеопластичность, индуцируя апоптоз. NDV-TRAIL и бифункциональный NDV-IL2-TRAIL показали превосходную апоптотическую функцию по сравнению с NDV-IL2. Более того, индуцировалась пролиферация CD4+ и CD8+ и вызывалась экспрессия противоопухолевых цитокинов TFN-α и IFN-γ. NDV-IL2-TRAIL также показал увеличенную выживаемость у мышей, которым имплантировали ксенотрансплантаты ГЦК и меланомы. В другом исследовании штамм NDV Anhinga был использован для экспрессии растворимого TRAIL (NDV / Anh-TRAIL), что привело к эффективному подавлению ГЦК без значительной цитотоксичности.

Вирусы Коксаки

Вирусы Коксаки использовались для нескольких вариантов генной терапии. Например, вирус Коксаки B3 (CVB3), экспрессирующий фактор роста фибробластов 2 человека (FGF2), вводили в ишемические задние конечности мышей, демонстрирующих защиту от ишемического некроза. Лечение улучшило кровоток в ишемизированных конечностях более чем на 3 недели. Более того, рекомбинантный CVB3 показал резкое снижение вирулентности по сравнению с CVB3 дикого типа. Связанный с раком вирус Коксаки A21 (CAV21), экспрессирующий молекулу межклеточной адгезии-1 (ICAM-1) и фактор ускорения распада (DAF), снижает опухолевую нагрузку у мышей SCID без ожирения, имплантированных ксенотрансплантатами меланомы. Однократного введения CAV21 было достаточно для обеспечения эффективного онколиза, а системное распространение CAV21 показало эффективную регрессию в опухолях, удаленных от места инъекции вируса. Кроме того, тот же самый вектор CAV21 был оценен на мышах SCID, которым имплантированы ксенотрансплантаты опухоли молочной железы T47D и MDA-MB-231-luc. Одна внутривенная инъекция вызвала значительную регрессию ранее установленных опухолей, а также нацеливание и устранение метастазов. Кроме того, внутривенная инъекция CVA21, экспрессирующего ICAM-1 и DAF, в сочетании с внутрибрюшинной инъекцией гидрохлорида доксорубицина обеспечивала значительно усиленную регрессию опухоли по сравнению с одним вирусом или лекарством у мышей с имплантированными опухолями MDA-MB-231. Связанные с раком простаты низкопатогенные энтеровирусы CVA21, CVA21-DAFv и Echovirus 1 (EV1) были протестированы на мышах SCID. Системная доставка индуцировала регрессию опухолевых ксенотрансплантатов, и была получена терапевтическая доза-ответ для возрастающих доз EV1 на мышиной модели LNCaP.

Поксвирусы

Наконец, поксвирусы нашли несколько применений в качестве векторов генной терапии. Например, векторы вируса осповакцины продемонстрировали потенциал для лечения рака поджелудочной железы. В этом контексте была применена система PANVAC, состоящая из рекомбинантных вирусов осповакцины и оспы птиц, несущих опухоль-ассоциированные эпителиальные антигены MUC-1 и карциномебриональный антиген (CEA), а также молекулы, стимулирующие Т-клетки. Последовательное подкожное введение векторов обеспечивало индуцированные ответы ЦТЛ CEA и MUC-1 в доклинических моделях на животных. В случае ГЦК светоизлучающий рекомбинантный вирус осповакцины GLV-2b372 вводили в ксенотрансплантаты ГЦК в бок бестимусных голых мышей для оценки роста опухоли и ингибирования биораспределения вируса. Было продемонстрировано, что через 25 дней после инъекции объемы опухоли по бокам уменьшились на 50%, тогда как у контрольных мышей объемы опухоли увеличились на 400%. Связанная с раком простаты экспрессия NIS из вируса осповакцины GLV-1h153 в сочетании с лучевой терапией была оценена на голых мышах CD1, которым имплантировали ксенотрансплантаты PC3. Комбинированная терапия превосходила индивидуальные методы лечения как на моделях ксенотрансплантатов, так и на иммунокомпетентных трансгенных моделях аденокарциномы простаты мышей (TRAMP), демонстрируя ограниченный рост опухоли и улучшенные показатели выживаемости. Вирус осповакцины был сконструирован путем мутации гена F4L, вирусного гомолога регулируемой клеточного цикла малой субъединицы рибонуклеотидредуктазы 2 (RRM2), которая обеспечивала селективную репликацию опухоли и уничтожение клеток. Было подтверждено, что F4L-мутантный вектор селективно реплицировался в иммунокомпетентных моделях рака мочевого пузыря крысы AY-27 и ксенотрансплантатах RT122-люкортопического рака человека, что приводило к значительной регрессии опухоли или полной абляции, не вызывая какой-либо цитотоксичности. Кроме того, у крыс, излеченных от опухоли AY-27, установлен противоопухолевый иммунитет. Недавно был разработан новый вектор вируса коровьей оспы (CPXV) с делецией гена тимидинкиназы (TK) и вставкой гена самоубийства FCU1, который отвечает за превращение 5-FC в 5-FU и 5-FUMP. Системное введение модифицированного вектора CPXV показало накопление в опухолевых клетках и низкую инфекцию и токсичность нормальных клеток. Более того, внутриопухолевое введение на моделях глиобластомы U-87-MG и рака толстой кишки LoVo индуцировало соответствующее ингибирование роста опухоли.

Клинические испытания

Было проведено или в настоящее время проводится значительное количество клинических испытаний с применением вирусных векторов. Например, опухоль-селективный химерный аденовирусный вектор Энаденотуцирева был подвергнут внутривенной доставке 17 пациентам с резектабельным колоректальным раком, немелкоклеточным раком легкого, уротелиальным раком и раком почек. Специфическая для опухоли доставка наблюдалась в большинстве образцов опухолей без серьезных побочных эффектов, связанных с лечением.

В отношении гемофилии генная терапия используется уже три десятилетия, в основном сосредоточиваясь на векторах на основе ААВ. Помимо открытия ранее существовавших нейтрализующих антител в моделях на животных, клинические испытания показали, что уровни трансаминаз печени повышены, а экспрессия трансгена связана с иммунной потерей. Механизм снижения уровней экспрессии до конца не изучен, но использование различных серотипов для последовательного введения ААВ обеспечило улучшенную экспрессию трансгена, что привело к долговременной экспрессии факторов VIII (FVIII) и IX ( FIX) и, кроме того, позволяет вылечить сильные кровотечения и повреждения суставов, связанные с гемофилией. В этом контексте было проведено 11 клинических испытаний генной терапии гемофилии, а в шести текущих клинических испытаниях фазы I / II с некоторым успехом применялись направленные на печень ААВ, экспрессирующие либо FVIII, либо FIX. Кроме того, доставка лентивирусного вектора на основе стволовых клеток оказалась успешной в установлении устойчивого высокого уровня экспрессии FIX после дифференциации адипогенных, хондрогенных и остеобластных клеток, что потенциально может быть применено для лечения гемофилии B. Аналогичным образом, на основе стволовых клеток. Лентивирусная генная терапия может обеспечить пожизненное производство FVIII и потенциальное излечение от гемофилии A.

Онколитический вектор ВПГ HF10 был подвергнут клиническим испытаниям при рецидивирующем раке груди, раке головы и шеи, неоперабельном раке поджелудочной железы, рефрактерном поверхностном раке и меланоме. Исследования продемонстрировали высокую безопасность и низкую частоту побочных эффектов у пролеченных пациентов. Более того, антигены HF10 были обнаружены через 300 дней после иммунизации у пациентов с раком поджелудочной железы. Комбинированная терапия HF10 и ипилимумабом (анти-CTLA-4) показала хороший профиль безопасности и хорошую противоопухолевую эффективность в исследовании II фазы. Что касается ретровирусов, в настоящее время проводится клиническое испытание ретровируса Toca 511 на пациентах с рецидивирующей глиомой высокой степени злокачественности (HGG). Более того, Toca 511 был подвергнут открытому многоцентровому исследованию I фазы с возрастающей дозой у пациентов с рецидивирующим или прогрессирующим HGG. Общая выживаемость составила 13,6 месяцев и статистически лучше, чем в группе внешнего контроля. Более того, образцы опухолей от пациентов, выживших более года, продемонстрировали экспрессию РНК, связанную с выживанием, в корреляции с выживаемостью, связанной с лечением. В настоящее время проходит II / III фазы испытания Toca 511. В другом подходе гаммаретровирусный вектор был использован для лечения хронической гранулематозной болезни (ХГБ), которая связана с первичным иммунодефицитом, что приводит к нарушению антимикробной активности фагоцитарных клеток. Исследование I / II фазах показало, что, хотя бактериальные и грибковые инфекции были временно разрешены, доминирование клонов и злокачественные трансформации ставили под угрозу терапевтический эффект, что позволяет предположить, что для доставки следует рассмотреть альтернативные векторы. В другом подходе, связанном с раком, MV-NIS был одобрен FDA(*Американский аналог Роспотребнадзора) для клинических испытаний на людях у пациентов с миеломой, что могло бы обеспечить потенциальную стратегию для нацеливания на йод-резистентные ATC. Вирусы онколитической осповакцины также были подвергнуты клиническому исследованию I фазы у 11 пациентов с резистентным распространенным колоректальным или другим солидным раком. Исследование не показало ни дозозависимой токсичности, ни каких-либо серьезных побочных эффектов, связанных с лечением. Однако сильная индукция воспалительных цитокинов и цитокинов Th1 указывает на мощное опосредование потенциального иммунитета против рака, что поддерживает дальнейшие испытания с внутривенным введением вируса осповакцины в сочетании с экспрессией терапевтических генов, блокадой иммунных контрольных точек или ингибиторами комплемента. В другом исследовании с применением поксвирусов схема вакцинации PANVAC-VF, состоящая из первичной дозы рекомбинантного вируса осповакцины и бустерных доз рекомбинантного вируса оспы птиц, экспрессирующих CEA, MUC-1 и триаду костимулирующих молекул (TRICOM), подвергалась подкожному введению в пациенты с распространенным раком поджелудочной железы. Была продемонстрирована безопасность и способность PANVAC-VF индуцировать антиген-специфические Т-клетки. Однако испытание III фазы, направленное на пациентов с метастатическим раком поджелудочной железы, не смогло достичь терапевтических целей и было прекращено. В другом подходе испытание I фазы прямого внутриопухолевого введения PANVAC-VF дало некоторые обнадеживающие результаты.

В контексте клинических испытаний, основанных на ВПГ, онколитический вектор ВПГ M032, экспрессирующий IL-12, был подвергнут I фазе исследования с увеличением дозы у пациентов с рецидивирующей или прогрессирующей злокачественной глиомой. Более того, штамм ВПГ G207, лишенный генов, необходимых для репликации в нормальных клетках, был оценен у пациентов с рецидивирующей мультиформной глиобластомой. После двух доз ВПГ G207 (всего 1,15 x 109 БОЕ) ни у одного пациента не развился энцефалит, но значительная противоопухолевая активность не наблюдалась. Кроме того, исследование продемонстрировало безопасную доставку нескольких доз, включая прямые инъекции в мозг. В исследовании I фазы у пациентов с рецидивирующим / прогрессирующим HGG шесть из девяти пациентов имели стабильное заболевание с частичным ответом, а среднее время выживания составляло 7,5 месяцев после однократной инъекции онколитического ВПГ, что указывает на возможность клинического ответа. Кроме того, доклинические испытания ВПГ G207 привели к высокочувствительному уничтожению опухолей, что поддерживает начало исследования внутриопухолевого введения у детей с рецидивирующими или прогрессирующими супратенториальными злокачественными опухолями. Альфавирусы до сих пор прошли лишь ограниченное количество клинических испытаний. В этом контексте рекомбинантные частицы репликона VEE, экспрессирующие простатоспецифический мембранный антиген (PSMA), вводили пациентам с резистентным к кастрации метастатическим раком простаты в исследовании I фазы с увеличением дозы. Иммунизация не показала токсичности, но не было обнаружено PSMA-специфического клеточного иммунного ответа, только слабые сигналы, обнаруженные с помощью ELISA с дозой 9 x 106 МЕ.

Аналогичные результаты были получены при иммунизации 3,6 x 107 МЕ. Несмотря на отсутствие клинической пользы и устойчивых иммунных ответов, иммунизация вырабатывала нейтрализующие антитела, что способствует дальнейшим исследованиям по оптимизации доз. В другом подходе, в I фазе исследования у пациентов с меланомой и карциномой почки, векторы SFV с липосомной оболочкой, экспрессирующие IL-12, подвергались системному введению. Внутривенные инъекции обеспечивали кратковременное 5-кратное увеличение содержания IL-12 в плазме. Благодаря процедуре инкапсуляции достигается нацеливание на опухоль и защита от распознавания иммунной системой хозяина, что также позволяет многократно вводить вектор.

NDV использовался в ряде клинических исследований. Например, было продемонстрировано, что NDV, экспрессирующий несколько опухольассоциированных антигенов (TAA), обеспечивает долгосрочную выживаемость в исследованиях II фазы у пациентов с раком яичников, желудка и поджелудочной железы. Кроме того, пациенты с меланомой были иммунизированы NDV в рандомизированном двойном слепом исследовании II / III фазы. Однако результаты исследования показали, что не было заметных различий между вакцинированными людьми и участниками группы плацебо. В исследовании II фазы 79 пациентов с солидными опухолями были подвергнуты внутривенному введению штамма NDV PV101. Применяли более низкую дозу 12 x 109 БОЕ/м2 и МПД 12 x 1010 БОЕ/мл, что привело к объективному ответу на более высокую дозу и выживаемости без прогрессирования заболевания в диапазоне от 4 до 31 месяца. В другом исследовании фазы III 335 пациентов с колоректальным раком прошли иммунотерапию NDV. Было продемонстрировано, что вакцинация NDV обеспечивает длительную выживаемость и краткосрочное улучшение качества жизни.

При изучении генной терапии ВИЧ (*вирус иммунодефицита человека — ретровирус из рода лентивирусов) лентивирусные векторы были использованы для нацеливания на CCR5 путем доставки shРНК. Было продемонстрировано, что shРНК эффективно ингибируют экспрессию CCR5, обеспечивая защиту от ВИЧ-1 инфекции в культурах клеток. Более того, был разработан самоактивирующийся лентивирусный вектор для экспрессии комбинации гена sh5 против ВИЧ и пептида-ингибитора антивирусного слияния C46, который обеспечивает синергетический эффект на ингибирование ВИЧ-1. Многообещающие результаты доклинических испытаний послужили толчком к проведению первых клинических испытаний I фазы, в которых использовалась РНК-интерференция для подавления экспрессии CCR5 при терапии ВИЧ.

Связанное с вирусами Коксаки, исследование I / II фазы у пациентов с меланомой с CVA21 показало хорошую переносимость, репликацию вируса в опухолях и повышенную противоопухолевую активность. Последнее может быть дополнительно усилено комбинированной терапией с блокадой иммунных контрольных точек. В другом исследовании II фазы CVA21 продемонстрировал индуцированную инфильтрацию иммунных клеток в микроокружении опухоли пациентов с меланомой. Более того, комбинированная терапия CVA21 и системным пембролизумабом в исследовании 1b фазы у пациентов с меланомой показала лучший общий ответ 60% и стабильное заболевание у 27% пациентов. Не наблюдались ни ограничивающая дозу токсичность, ни побочные эффекты, связанные с лечением 3-й и более высокой степени.

В контексте муковисцидоза(МВ) псевдотипированный лентивирусный вектор со слитым белком (F) / гемагглютинин-нейраминидазой (HN) был оптимизирован для последовательностей промотора / усилителя и оценен на мышах и культурах интерфейса воздух-жидкость человека (ALI) при подготовке к первому клиническому исследованию МВ. Лентивирусный вектор, несущий гибридный цитозингуаниндинуклеотид (CpG) без усилителя CMV / альфа-промотора фактора элонгации 1 (hCEF), экспрессировал функциональный CFTR, сохранял эффективность трансдукции 90–100% в клинически значимых устройствах доставки и демонстрировал приемлемую токсичность и профили участков интеграции для поддержки начала клинических испытаний у пациентов с МВ.

Утвержденные препараты

Первые препараты для генной терапии на основе вирусов были одобрены некоторое время назад в Китае. В этом контексте онколитические аденовирусы, экспрессирующие ген p53 (GendicineTM), и AdH101, содержащие делецию E1b-55K, используются для лечения рака с мутированным p53 и рака головы и шеи, соответственно. GendicineTM использовался в течение 12 лет у более чем 30 000 пациентов с образцовой безопасностью и обеспечил значительно лучший ответ по сравнению со стандартными методами лечения в сочетании с химиотерапией и лучевой терапией. Кроме того, время выживания без прогрессирования было значительно увеличено.

Кроме того, онколитический вектор ВПГ второго поколения, экспрессирующий GM-CSF, был одобрен в США и Европе для лечения меланомы. К сожалению, хотя препарат Glybera на основе ААВ был одобрен для лечения редкого наследственного заболевания, связанного с недостаточностью липопротеин липазы, высокая стоимость и ограниченный спрос вынудили его уйти с рынка.

Кроме того, в ближайшем будущем на рынке, скорее всего, появятся несколько других препаратов на основе вирусов. Например, онколитический VV JX-594 (пексастимоген девацирепвек) для лечения гепатоцеллюлярной карциномы, Ad CG0070, экспрессирующий GM-CSF, для рака мочевого пузыря и пелареореп на основе ретровируса дикого типа (Реолизин®) для лечения рака головы и шеи находятся на поздней стадии развития. Более того, онколитический ВПГ-1 G47Δ третьего поколения, который был подвергнут исследованию II фазы глиобластомы, был далее обозначен как революционная терапия «Сакигаке», которая обеспечит приоритетное рассмотрение и ускоренное одобрение.

Выводы

Таким образом, в области генной терапии наблюдается значительный прогресс: к 2017 г. было проведено около 3000 клинических испытаний. Неудивительно, что 64,6% исследований относятся к терапии рака. Кроме того, 10,5% сосредоточены на моногенных заболеваниях, 7,4% - на инфекционных заболеваниях и 7,4% - на сердечно-сосудистых заболеваниях. Интересно, что почти в 70% испытаний использовались вирусные векторы. Несмотря на недавние разработки методов манипуляции генами, таких как CRISPR, и более эффективных способов доставки невирусных векторов, вирусные векторы по-прежнему остаются привлекательными.

В целях дальнейшего улучшения применимости вирусных векторов был введен ряд модификаций. Например, проблема инсерционного онкогенеза ретровирусов, приводящего к активации LMO2 или других онкогенов, была серьезной проблемой при лечении SCID. По этой причине был разработан новый анализ для оценки безопасности векторов, связанных со вставками в локус LMO2 и другие протоонкогены Т-клеток. Выявлено, что гамма-ретровирусные векторы с полными вирусными длинно-концевыми повторами наиболее предрасположены к активации пути LMO2. С другой стороны, лентивирусные векторы показали значительно меньшую тенденцию к активации протоонкогенов. Лентивирусы третьего поколения также способствовали улучшению доставки и безопасности. Например, делеция вирусного гена tat делает вектор некомпетентным к репликации. Кроме того, функции упаковки лентивирусного вектора были возложены на три плазмиды вместо двух, чтобы снизить риск рекомбинации. Модификации 3'LTR предотвращают переупаковку интегрированных генов, обеспечивая самоинактивирующуюся систему. Кроме того, лентивирусные векторы с псевдотипом VSV-G обеспечивают трансдукцию гораздо более широкого диапазона типов клеток и повышенную стабильность вектора, что способствует высокой концентрации вектора с высоким титром с помощью ультрацентрифугирования. Другая проблема связана с генетическими вариациями хозяина, влияющими на экспрессию трансгена из лентивирусных векторов, который был изучен на 12 совместных кросс-линиях мышей. Экспрессию люциферазы в организме самок мышей контролировали после введения лентивирусного вектора со специфическим для печени промотором. Исследование выявило основную штамм-специфичную трансдукцию, биораспределение векторов, максимальную экспрессию и кинетику люциферазы, подчеркнув важность генетической изменчивости и необходимость пересмотра доклинических исследований.

Будущее вирусной генной терапии, даже при осторожном подходе, кажется радужным. Одобрение нескольких препаратов для лечения различных состояний с применением различных вирусных векторов обеспечивает значительную гибкость и альтернативные варианты стратегии. Прогресс, достигнутый в разработке переносчиков и разработке средств безопасности, также поставил вирусные векторы в благоприятное положение. Однако как доклинические, так и клинические исследования подтвердили, что не существует единого универсального вирусного вектора, подходящего для лечения всех показаний. Таким образом, на выбор вектора влияют такие факторы, как уровень экспрессии терапевтического агента, продолжительность экспрессии и даже личный опыт и предпочтения исследователей / клиницистов. Поскольку персонализированные лекарства стали неотъемлемой частью разработки современных лекарств, вирусные переносчики также должны найти потенциальные возможности в этой области. В этом контексте могут быть созданы улучшенные аденовирусные векторы для персонализированной доставки лекарств. В другом подходе библиотека генов опухолевых антиген-специфических Т-клеточных рецепторов (TCR) из замороженных биоптатов опухоли была введена в ретровирусный вектор, что позволило быстро получить терапевтические персонализированные противоопухолевые Т-клеточные продукты.

Поэтому бесполезно пытаться вносить предложения о том, какую систему вирусных векторов использовать, а скорее поощрять параллельную разработку нескольких систем, а затем принимать соответствующие решения на основе публикаций и предыдущего опыта. Как бы то ни было, вирусная генная терапия получила существенное развитие и становится ключевым методом лечения в современной медицине.

*комментарии редактора